Introduction
Le Service de Lutte contre la Tuberculose et la Lèpre (Ministère de la Santé et du Planning Familial) conduit un programme d’élimination de la lèpre (PNEL) en partenariat avec l’OMS, la FRF et le NLR. Bien que Madagascar ait atteint l’objectif de l’OMS d’élimination de la lèpre en tant que problème de santé publique, avec une prévalence actuelle < 1 pour 10 000 habitants sur l’ensemble du pays, la prévalence est encore supérieure à 1 pour 10 000 dans certaines régions comme celles de Fianarantsoa, Antsiranana, Toliara et Mahajanga. Une des difficultés majeures de la lutte contre la lèpre est l’éloignement des patients des centres de santé de base (CSB), rendant ainsi difficiles le dépistage et le suivi. L’apparition de souches de M. leprae résistantes aux antibiotiques est à craindre chez les patients irréguliers et dans les cas de rechute.
Les tests de sensibilité de M. leprae aux antibiotiques sur coussinets plantaires de souris ne sont pas réalisables dans la majorité des pays endémiques de lèpre. Une technique de PCR-hybridation, réalisée sur biopsies cutanées de lésions lépreuses multibacillaires (MB), a été mise au point par N Honoré et St Cole (Unité de Génétique Moléculaire Bactérienne, Institut Pasteur, Paris) pour détecter les mutations responsables de la résistance à la rifampicine, au niveau du codon Ser425 du gène rpoB de M. leprae. Une autre méthode de détection, la Touch-down-PCR en temps réel a été mise au point à l’IPM.
Par ailleurs, le prélèvement de biopsie peut présenter des inconvénients comme le risque d’infection et la nécessité de faire une anesthésie locale. La biopsie n’est pas non plus recommandée chez les enfants et n’est pas réalisable pour les lésions du visage. Il était donc intéressant de tester ces deux techniques de PCR pour la détection des mutations à partir d’ADN extrait des sérosités déjà fixées sur les lames utilisées pour le diagnostic bacilloscopique de la lèpre.
Objectifs
Les principaux objectifs de ce projet étaient :
- mettre en place la méthode de PCR-hybridation pour la détection des mutations du codon Ser425 du gène rpoB à l’Institut Pasteur de Madagascar (IPM)
- développer une autre méthode rapide de détection des mutations, basée sur la Touch-down-PCR, en utilisant la technologie de PCR en temps réel avec l’intercalant Sybr Green I (TD-PCR-SG)
- évaluer la faisabilité de ces deux techniques à Madagascar pour la prédiction de la résistance des
M. leprae à la rifampicine à partir de biopsies de lésions MB de patients MB et à partir de prélèvements de sérosités MB ; puis d’étudier la résistance de M. leprae dans des régions endémiques.
Les patients inclus dans l’étude étaient les malades lépreux MB nouveaux cas, les patients suspects de rechute MB et les malades irréguliers. Les patients ont été recrutés soit par les personnels des CSB soit par les médecins recrutés spécifiquement pour le projet au cours des missions effectuées dans les régions endémiques de lèpre. Les patients lépreux ont d’abord été détectés suivant les critères de diagnostic clinique (multibacillaire [MB], paucibacillaire [PB]). Pour les patients suspects de lèpre MB, des frottis de sérosités (OG, OD, et/ou lésions cutanées) ont été réalisés pour la confirmation du diagnostic par la bacilloscopie. Une biopsie cutanée de lésion lépreuse MB a été prélevée. Pour les patients recrutés en 2006 et 2007, l’examen anatomopathologique sur les biopsies a également été réalisé pour le diagnostic.
Les ADN ont été extraits des biopsies et des sérosités par la méthode de congélation-décongélation et/ou la méthode au Chelex 5%. Les ADN ont été analysés par la méthode de PCR-hybridation reverse, développée par N Honoré et coll. (IPP). Les ADN ont aussi été testés par la technique de Touch-Down-PCR en temps réel avec l’agent intercalant Sybr Green (TD-PCR-SG) qui a été développée à l’IPM.
Les ADN standard utilisés comme témoins positifs étaient des plasmides portant une séquence du gène rpoB avec respectivement le codon sauvage Ser425, et les codons mutés Ser425Leu, Ser425Met et Ser425Phe. Des ADN extraits de biopsies de pattes de souris infectées par des M. leprae mutés sur le codon Ser425 du gène rpoB ont été utilisés pour la validation des deux tests moléculaires. Ces ADN ont été fournis par N Honoré (IPP).
· Recrutement des patients MB et diagnostic de la lèpre
Au total, depuis 2002, 188 patients cliniquement suspects de lèpre MB ont été recrutés dans différentes régions endémiques de lèpre à Madagascar (Est, Sud-Est, Ouest et Sud-Ouest) ainsi que dans la capitale Antananarivo. Parmi ces patients, 55 ont été confirmés lépreux MB soit par la bacilloscopie positive sur les sérosités soit par l’examen anatomopathologique. Il s’agissait de 34 nouveaux cas, 11 suspects de rechutes, 5 perdus de vue ou malades irréguliers et 5 patients dont l’historique de la lèpre n’était pas connu. L’âge moyen des patients était de 35,7 ans (variant de 12 à 74 ans) ; 5 d’entre eux avaient moins de 15 ans. Sur ces 51 patients MB, 45 ont eu une biopsie cutanée de lésion.
· Évaluation des deux tests de résistance par PCR sur biopsies de patients lépreux MB
Les résultats des PCR à partir des ADN extraits de biopsies MB ont été décrits dans le rapport d’activité 2006. En résumé, sur 28 ADN ayant donné des résultats interprétables par les deux techniques, 24 (13 de nouveaux cas, 6 suspects rechutes, 1 perdu de vue, 4 cas inconnus) ont été trouvés avec le codon sauvage Ser425 par les 2 méthodes de PCR. Par contre pour 4 patients dont les ADN ont été trouvés sensibles par la PCR-hybridation, les résultats par la TD-PCR-SG étaient différents : les biopsies N°171 et N° 231 (mélange des allèles Ser425 et Ser425Leu), la biopsie N°167 (Ser425Leu) et la biopsie N°172 (Ser425Phe).·
Résultats des tests de résistance réalisés à partir de sérosités de lésions MB
L’extraction de l’ADN a été faite à partir de 51 lames dont l’indice bacillaire (IB) était positif au moment du diagnostic. Avant l’extraction, les lames ont toutes été relues au microscope : 31 avaient un IB >0 et 20 avaient un IB nul.
Sur les 51 ADN extraits de sérosités, seulement 2 ont donné un résultat positif par la PCR-hybridation. Ces deux échantillons portaient l’allèle sauvage Ser425.
Sur 49 extraits de sérosités (de 31 patients) qui ont été analysés par la méthode de TD-PCR-SG, 19 ADN (de 13 patients) ont donné un résultat interprétable. Ces ADN correspondaient à 18 sur 29 lames à IB>0 (62%) et 1 sur 20 lames à IB=0. 17 ADN portaient le codon Ser425. Par contre pour 2 sérosités, en plus du codon sauvage Ser425, on a obtenu une réponse avec respectivement le codon muté Ser425Leu et le codon Ser425Met, suggérant que ces ADN pourraient porter deux allèles différents du codon 425.
Conclusion
Les résultats ont montré que l’application des deux méthodes de PCR sur des biopsies cutanées de lésions à bacilloscopie positive était réalisable. La PCR-hybridation à partir de sérosités n’a pas été efficace. Bien que la TD-PCR-SG ait été moins sensible avec l’ADN des sérosités fixées sur lame (62%) qu’avec l’ADN extrait des biopsies (78%), elle peut être un recours si l’on veut réaliser une étude sur la résistance de M. leprae quand la pratique d’une biopsie n’est pas possible. Cependant la sensibilité est dépendante de la richesse en bacilles des prélèvements biologiques.
Par ailleurs, pour valider ces méthodes, il était nécessaire de disposer de plus d’échantillons provenant de patients en rechute MB pour augmenter les chances de trouver des M. leprae avec un gène rpoBmuté. Au total, seulement 11 patients suspects de rechute MB et 5 malades irréguliers ont été trouvés et inclus dans l’étude, ce qui est insuffisant pour l’évaluation de ces méthodes. Ceci montre la difficulté à diagnostiquer les patients MB et à les recruter dans un pays où seul le diagnostic clinique de la lèpre est possible dans les zones reculées.
