Institut Pasteur de Madagascar

Evaluation d’un test moléculaire d’amplification isotherme (LAMP) pour le diagnostic rapide des bactériémies chez l’enfant

Contexte et justification

Le taux de mortalité des enfants de moins de 5 ans est le plus élevé en Afrique sub saharienne, principalement en milieu rural où l’accès aux services de santé est généralement difficile. Dans cette région, les bactériémies sont maintenant reconnues comme une des principales causes de mortalité et de morbidité infantile. Bien que des moyens de prévention tels que les vaccins conjugués aient été développés contre un certain nombre de ces infections bactériennes, ils ne sont pas toujours abordables ou disponibles. Dès lors, la prise en charge rapide et efficace des cas reste le principal moyen de réduction des taux de mortalité infantile. Malheureusement, les profils cliniques des maladies pédiatriques sévères liées aux bactériémies se ressemblentt considérablement, ce qui rend difficile l’identification de la véritable cause de la maladie sur la seule base de la clinique. En complément des tests rapides d’immunochromatographie sur bandelette, les tests de détection d’acides nucléiques utilisables au chevet du patient (« Point-Of-Care ») permettent l’accès à des méthodes de diagnostic très demandées dans les régions à faibles ressources et à haut taux de morbidité, en particulier pour des applications nécessitant des délais de réponse rapides. Parmi ces méthodes, l’amplification isotherme facilitée par boucle (« LAMP » ou « Loop-mediated isothermal amplification ») semble être un essai prometteur, très adapté aux conditions de terrain. En plus de sa relative simplicité et des faibles coûts d’infrastructures, la technologie LAMP (i) a une température d’incubation moyenne conduisant à un chauffage simplifié à faible consommation d’énergie, (ii) a un rendement élevé de produits d’amplification, pouvant être détecté visuellement ou par des détecteurs simples, (iii) permet l’amplification génétique directe in situ de bactéries en raison de leur tolérance supérieure à des inhibiteurs connus de la PCR tels que le sang, (iv) a une grande spécificité et la sensibilité et (v) conduit à une détection rapide des produits souvent en 10 à 20 min. De plus, la préparation des acides nucléiques à partir du sang total peut être intégrée et associée à l’amplification LAMP et à la détection dans des systèmes miniaturisés automatisés, composés de réactifs stables, prêts à l’emploi et d’une instrumentation simple, ne nécessitant pas d’entretien. Ces systèmes doivent néanmoins produire des résultats clairs et facilement interprétables, en plus d’être suffisamment sensibles et spécifiques, être robustes, peu coûteux, fermés et faciles à utiliser par un personnel peu qualifié.

Le test en développement dans le cadre de ce projet sera basé sur une série de réactions d’amplification LAMP indépendantes très sensibles et spécifiques, intégrées dans un dispositif jetable et fermé. L’outil sera constitué d’un ensemble de puits réactionnels interconnectés contenant les amorces lyophilisées pour l’amplification LAMP, ne nécessitant qu’une seule étape de pipetage pour l’ajout de l’échantillon. L’étude sera conduite à Madagascar, Mayotte, au Mali et avec Epicentre en Ouganda. Le présent projet bénéficie de l’expérience et des outils développés par les équipes collaborant dans le cadre de leurs différents programmes de recherche.

Objectifs

L’objectif ultime de cette étude est de produire un dispositif jetable et fermé intégrant la préparation des acides nucléiques à partir du sang total associée à l’amplification LAMP et à la détection des cibles (S. pneumoniae, Salmonella spp., S. aureus, E. coli et H. influenzae de type b) dans des systèmes miniaturisés automatisés, composés de réactifs stables, prêts à l’emploi et d’une instrumentation simple.

Objectif principal : Déterminer les valeurs intrinsèques (sensibilité et spécificité) des tests LAMP individuels en microtubes et du test rapide de terrain pour le diagnostic de chaque pathogène des bactériémies chez les enfants.

Objectifs secondaires : i) Déterminer l’apport diagnostique ainsi que la fiabilité des tests individuels et du test rapide de terrain pour le diagnostic des bactériémies chez les enfants ; ii) Identifier les facteurs sociodémographiques et cliniques pouvant influencer les performances du test.

Méthodes

Type d’étude : Etude rétrospective multicentrique (Madagascar, Mayotte, Ouganda, Mali)

Population d’étude : Considérant une prévalence estimée à 10% des bactériémies, pour Madagascar, 1000 sujets volontaires mineurs de plus de 6 mois et de moins de 15 ans ayant consulté l’une des structures de santé pour un accès fébrile devront être recrutés pour avoir 100 sujets positifs aux cinq germes ciblés.

Méthodes : Les performances des tests LAMP individuels (en microtubes) et du test rapide de terrain seront comparées aux tests bactériologiques de référence (l’hémoculture) sur la base des critères d’évaluation suivant :

Résultats et discussion

En 8 mois (Mai 2016-Janvier 2017), 189 hémocultures ont été récoltées à partir de 177 enfants fébriles ; 12 ont été ré-inclus pour des raisons médicales (fièvre persistante, rechute…) ou suite à une contamination du prélèvement. L’âge moyen des enfants inclus était de 3,77 ans et 50% des enfants avaient moins de 2,16 ans. Le sex ratio (F/M) était de 1,01. Soixante-treize (73,5) % des patients (139/189) avaient reçus une antibiothérapie durant les 7 jours précédant leur inclusion dont principalement de la ceftriaxone (48%, 67/139).

Trente-sept hémocultures (19.5%) étaient positives  dont 24 (64.8%) étaient cliniquement significatives (trois d’entre elles étaient polymicrobiennes) et 13 (35%) présentaient des contaminations probables. Au total, 42 souches bactériennes ont été isolées dont des entérobactéries qui étaient prédominantes (n=15) suivies par des bactéries à gram positif (n=6), des bactéries à gram négatif autres que des entérobactéries (n=4) et des bactéries opportunistes (n=3).

Onze entérobactéries sur 15 (73%) produisaient des bêta-lactamases à spectre étendu (BLSE) et 5 d’entre-elles étaient aussi résistantes aux fluoroquinolones. Aucun S. aureus résistant à la méthicilline (SARM) n’a été détecté, mais 6 staphylocoques à coagulase-négative sur 11 des (54%) étaient résistants à la méthicilline.

En conclusion, après cette première année d’inclusion, le nombre d’hémocultures récoltées était bien en deçà du nombre prévu (on vient d’inclure un deuxième site de recrutement) et les principales causes de bactériémies des enfants à Madagascar ne correspondaient pas au panel des 5 bactéries préalablement choisies (6/37 hémocultures correspondaient à une de ces 5 espèces). L’étude à Madagascar a montré une grande diversité bactérienne dans les hémocultures réalisées dont principalement des entérobactéries.

Impact

L’outil de diagnostic qui sera produit à l’issu de ce projet de recherche sera facile à manipuler pour les personnels de santé et moins coûteux par rapport aux examens de routine pour le diagnostic des bactériémies. Le diagnostic au chevet du malade (« Point-Of-Care ») des agents pathogènes permettra une prise en charge rapide et efficace des enfants malades, réduisant ainsi la morbidité et la mortalité dues aux bactériémies.

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